Главная > Новости с мира биологии > Трансформация эукариотических клеток с использованием синтетических полимерных катионов
Трансформация эукариотических клеток с использованием синтетических полимерных катионов31-03-2010, 22:25. Разместил: FnX |
Доставка чужеродных нуклеиновых кислот внутрь интактных клеток, или трансформация, лежит в основе многих методов генной инженерии. Транспортировка функциональных генов в ткани может сделать возможной коррекцию генной недостаточности и мутаций, следствием которых являются тяжелые наследственные патологии или раковые опухоли. В настоящее время разработан целый ряд приемов для введения ДНК в клетки, среди которых наиболее распространены преципитация фосфатом кальция или диэтиламиноэтил-декстраном (ДЕАЕ-декстраном), электропорация, микроинъекция, встраивание ДНК в реконструированную оболочку вирусов или липосомы (искусственные мембранные липидные везикулы). Несмотря на разнообразие этих методов, поиск новых путей трансформации про- и эукариотических клеток продолжается. С одной стороны, это вызвано необходимостью повышения эффективности трансформации, с другой – перечисленные выше методы применимы лишь для ограниченного числа клеточных линий и неэффективны при попытках введения в клетки РНК. Наконец, большинство этих подходов не может быть использовано для генетической трансформации in vivo. В качестве переносчиков ДНК используются ретровирусные векторы, векторы на основе ДНК-содержащих вирусов и ВИЧ, липосомы на основе катионных липидов, полимерные ДНК-связывающие катионы. Использование синтетических полимеров в качестве переносчиков ДНК имеет ряд преимуществ: удобство хранения и очистки, простота тестирования токсичности и безопасности и, что особенно важно для генной терапии, снижение риска патогенетических и иммунологических осложнений. При смешивании растворов линейных поликатионов и ДНК формируются интерполиэлектролитные комплексы (ИПЭК) за счет образования кооперативной системы межцепных электростатических связей. При этом поликатионные цепи окружают молекулу ДНК, образуя сферы или тороиды, в зависимости от типа полимера. Включение в ИПЭК приводит к компактизации ДНК, повышению ее устойчивости к действию нуклеаз, способствует усилению ее взаимодействия с клеточной мембраной и повышению трансформирующей активности по отношению как к прокариотическим, так и эукариотическим клеткам. Соединяя молекулы поликатиона с лигандами, способными к специфическому связыванию с клеточной мембраной, можно обеспечить проникновение ИПЭК в клетку по рецепторному пути, а в организме – адресную доставку к клеткам-мишеням. Системы доставки ДНК для применения в генной терапии должны обеспечивать проникновение ДНК в нужный орган, ткань, или в конкретную группу клеток, а затем – в клеточное ядро. Антисмысловые олигонуклеотиды, а именно они чаще всего используются в генной терапии, должны найти ту мРНК или участок хромосомной ДНК, против которой они направлены. Введенный ген должен войти в состав конструкции, способной его экспрессировать. Однако это довольно сложная проблема. При введении нуклеиновой кислоты или олигонуклеотида в организм они не попадут преимущественно к нужной ткани или нужному органу, а та их часть, которая окажется в нужном месте, лишь в незначительной мере сможет пройти сквозь гидрофобную клеточную мембрану. Кроме того, в ходе эволюции были выработаны механизмы защиты клеток организма от вторжения факторов внешней среды, в том числе и чужеродной ДНК. Оказавшись внутри клетки, чужеродная ДНК может локализоваться не там, где это необходимо и, более того, может оказаться в лизосомах, где будет разрушена под действием нуклеаз. Проникновение в клетку и внутриклеточный транспорт ИПЭК происходит, возможно, за счет образования и последовательного разрушения эндосом. На каждом из этапов этого процесса существенная часть материала теряется. Скудное высвобождение векторов из эндосом в цитоплазму и неэффективный перенос их в ядро приводят к низкой эффективности трансгенной экспрессии.
Векторы на основе фага М13Можно выделить три пути повышения эффективности переноса ДНК в эукариотические клетки с помощью синтетических поликатионов. Во-первых, это повышение специфичности трансфекции* за счет лигандов, соединенных с молекулой поликатиона и обеспечивающих избирательное взаимодействие комплексов с клетками определенного фенотипа. Во-вторых – повышение эффективности трансформации за счет подбора генов или олигонуклеотидов, внедряемых в клетку. В-третьих – повышение частоты трансфекции, которое достигается за счет применения лигандов, более эффективно взаимодействующих с клеточной мембраной, и веществ, дестабилизирующих мембрану. Кроме того, возможен синтез новых поликатионов. В лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии НИИ гриппа РАМН в Санкт-Петербурге проводится изучение средств доставки ДНК и вирусных частиц в клетки. В этой работе используется набор полимерных носителей, синтезированный сотрудниками Института высокомолекулярных соединений РАН. В качестве экспрессионных векторов использовались плазмиды: pUC 18, содержащая цитомегаловирусный промотор и ген b-галактозидазы, и pBR 322, содержащая цитомегаловирусный промотор и ген зеленого флуоресцирующего белка водорослей. В результате проведенных исследований было выяснено, что наибольшую трансфекционную активность имеют ИПЭК поли-(2-(диметиламино)этил)метакрилата (PDMAEMA) с низкими молекулярными массами. Дальнейшие исследования позволят разработать новые подходы к решению актуальных проблем в вирусологии, молекулярной и клеточной биологии, генной инженерии, генной терапии. Вернуться назад |